دانشیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران ، Dr_kumarss_amini@yahoo.com
چکیده: (1412 مشاهده)
زمینه و هدف: استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک، دیپلوکوک گرم مثبت به قطر ۵/۰ تا ۲/۱ میکرومتر، آلفا همولیتیک و تحملکننده اکسیژن از جنس استرپتوکوکوسو عامل بیماریهایی چون مننژیت و ذات الریه میباشد.باکتری حامل ژن پروتئین سطحی PneumococcalA (PspC)از S بوده و هدفی امیدوارکننده برای فرمولاسیون های واکسن جدید است. به همین جهت هدف از انجام این تحقیق جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (psp)استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشرشیاکلی DH5 آلفا به منظور تهیه واکسن برای کودکان میباشد. مواد و روشها: نمونهها از تعداد 100 کودک سالم، در مهـد کودک هـای شـهر اراک به طور تصادفی از نازوفارنژیال کودکان سالم زیـر 6 سـال بود که در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسـازی شد. به منظور جداسازی و شناسایی اولیه استرپتوکوک پنومونیه از محیط کشت و آزمون های بیوشیمیایی استفاده شد و استخراج DNA صورت گرفت. از طریق آزمون PCR سویه های واجد ژن pspC شناسایی شد. ژن pspCسویه های مثبت از طریق وکتور به باکتری میزبان اشرشیاکلی الحاق و از طریق تکنیک TA کلونینگ کلون شدند و در پایان از طریق تکنیک Real time PCR میزان بیان ژنها در اشرشیا کلی DH5 آلفا سنجیده و برای رسم درخت فیلوژنی از نرمافزارclustalXوMega5استفاده شد. یافته ها: از غربالگری نمونه های بالینی ارسالی به آزمایشگاه که براساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی تعیین هویت شدند در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسازی شد. و از این تعداد 1 ایزوله دارای ژن pspC بود. پس از کلونینگ، ژن های pspC، سویه های کلون شده کلنی سلکشن (آبی/سفید) جداسازی شدند. به منظور تایید نتایج کلونینگ DNA , از کلنی های مشکوک استخراج و توسط آزمون Real time PCR گردید.در نهایت تصاویر سکانسینگ، m13و منحنی تکثیر، بیان ژندر باکتری اشریشیاکلی DH5αرا تایید کرد. نتیجه گیری: در این مطالعه با ارزیابی ژنومی پنوموکوک جدا شده از کودکان زیر 6 سال، ژن pspC با پتانسیل ایمن سازی و به منظور ساخت واکسن از این باکتری استخراج گردید و کلونینگ با موفقیت صورت گرفت. در نهایت با بررسی درخت فیلوژنی رسم شده در این مطالعه میزان تشابه و خویشاوندی گونه استرپتوکوک پنومونیه با سایر گونهها نشان داده شد.