fa کلونینگ و تعیین توالی ژن کد کننده لیپوپروتئین سطحی LipL41 در باکتری لپتوسپیرا اینتروگانس سرووار گریپوتیفوزا تخصصي Special پژوهشي Research زمینه و هدف: لپتوسپیروزیس یک بیماری عفونی می‌باشد که توسط سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا ایجاد می‌شود. افزایش ارتقای کیفی روش‌های کاربردی و معتبر در تشخیص این بیماری و همچنین تولید واکسن نوترکیب ، نیاز به آنتی‌ژن‌های اختصاصی دارد که در بین سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا یکسان و مشابه است. پروتئین‌های غشای خارجی لپتوسپیرا (OMPs)، آنتی‌ژن‌های مؤثری می‌باشند که قادر به تحریک پاسخ ایمنی مشخص در دوره عفونت می‌باشند. در بین این آنتی‌ژن ها، LipL41 یک لیپو پروتئین ایمونوژنیک است که تنها در سرووار‌های بیماریزا وجود دارد بنابراین می‌توان آن را به عنوان کاندیدای مناسبی در تهیه واکسن مؤثر و کارآمد و همچنین در روش‌های تشخیصی در نظر گرفت. به منظور تعیین میزان حفاظت شدگی ژن lipL41، این ژن در لپتوسپیرا اینتروگانس سرووار واکسینال و بومی گریپوتیفوزا کلون و تعیین توالی گردید. مواد و روش‌ها: لپتوسپیرا اینتروگانس سرووار واکسینال و بومی گریپوتیفوزا جهت تلقیح در محیط کشت انتخابی(EMJH) مورد استفاده قرار گرفت و استخراج DNA ژنومی به روش استاندارد فنل کلروفرم انجام گردید. ژن lipL41 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر و در وکتور pTZ57R/T کلون گردید و به سلول‌های مستعد شده E. coli سویه Top10)) انتقال داده شد. سپس پلاسمید نوترکیب استخراج و تعیین توالی گردید. سکانس‌های مرتبط به منظور آنالیز همولوژی با سکانس‌های ثبت شده در بانک ژنی مقایسه شدند. یافته‌ها: محصول PCR ژن lipL41 یک قطعه 1065جفت بازی بود. که این قطعه در سرووار غیر بیماریزا L. biflexa مشاهده نگردید. بررسی توالی نوکلئوتیدی نشان داد که قرابت نوکلئوتیدی ژن lipL41 بین سرووار واکسینال RTCC2808)) و سرووار بومی بیماریزای RTCC2825)) گریپوتیفوزا 100% بود. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که ژن lipL41 با 9/95% تشابه یک ژن حفاظت شده در سرووارهای مختلف بیماریزا می‌باشد. از این رو ژن کلون شده در تحقیق حاضر را می‌توان با هدف بیان پروتئین نو ترکیب در تهیه واکسن نوترکیب مؤثر و کارآمد و در روش‌های تشخیصی لپتوسپیروزیس مورد هدف قرار داد. Background: Leptospirosis is an infectious bacterial disease caused by pathogenic serovars of Leptospira. Development of reliable and applicable diagnostic test and also recombinant vaccine for this disease require specific antigens that are highly conserved among diverse pathogenic leptospiral serovars. Outer membrane proteins(OMPs) of leptospira are effective antigens which can stimulate remarkable immune responses during infection, among them LipL41 is an immunogenic lipoprotein which is present only in pathogenic serovars so it could be regarded as a good candidate for vaccine development and diagnostic method. In order to identify genetic conservation of the lipL41 gene, we cloned and sequenced this gen from Leptospira interrogans serovar vaccinal and field of Grippotyphosa. Materials and Methods: Leptospira interrogans serovar vaccinal Grippotyphosa (RTCC2808) and serovar field Grippotyphosa (RTCC2825)were used to inoculate into the selective culture medium(EMJH). The genomic DNA was extracted by standard phenol-chloroform method. The lipL41 gene were amplified by specific primers and cloned into pTZ57R/T vector and transformed into the competent E. coli (Top10) cells. the extracted recombinant plasmid were sequenced. And the related sequences were subjected to homology analysis by comparing them to sequences in the Genbank database. Results: PCR amplification of the lipL41 gene resulted in the 1065 bp PCR product. DNA sequence analysis revealed that lipL41 gene between serovar vaccinal Grippotyphosa (RTCC2808)and serovar field Grippotyphosa (RTCC2825) in Iran was 100%. It was also showed that the lipL41 gene had high identity (96%-100%) with other pathogenic serovars submitted in Genbank database. Conclusion: The results of this study showed that the lipL41 gene was highly conserved among various pathogenic Leptospira serovars( >95.9 % identity). Hence the cloned gene could be further used for expression of recombinant protein for serodiagnosis and also can be a good candidate for vaccine against leptospirosis. لپتوسپیروزیس, لپتوسپیرا اینتروگانس, ژن lipL41 , کلونینگ, تعیین توالی Leptospirosis, Leptospira interrogans, lipL41 gene, Cloning, Sequencing 221 228 http://aums.abzums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-88&slc_lang=fa&sid=1 M.S. Soltani مریم سادات سلطانی 10031947532846002794 10031947532846002794 No Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad university, Tehran, Iran دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران P. Khaki پژواک خاکی p.khaki@rvsri.ac.ir 10031947532846002795 10031947532846002795 Yes Assistant Professor, National Reference Laboratory for Leptospira, Department of Microbiology , Razi Vaccine & Serum Research Institute, Karaj, Iran استادیار، آزمایشگاه رفرانس لپتوسپیرا، بخش میکروب‌شناسی موسسه تحقیقاتی واکسن و سرم سازی رازی، کرج، ایران S. Moradi Bidhendi سهیلا مرادی بیدهندی 10031947532846002796 10031947532846002796 No Assistant Professor, National Reference Laboratory for Leptospira, Department of Microbiology , Razi Vaccine & Serum Research Institute, Karaj, Iran استادیار، آزمایشگاه رفرانس لپتوسپیرا، بخش میکروب‌شناسی موسسه تحقیقاتی واکسن و سرم سازی رازی، کرج، ایران M.H. Shahhosseiny محمدحسن شاه حسینی 10031947532846002797 10031947532846002797 No Associate Professor, Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad university, Tehran, Iran دانشیار، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران