Alborz University Medical Journal

fa بررسی ژن‌های کدکننده کربنیک‌انهیدراز و معرفی بتا-کربنیک‌انهیدراز به‌عنوان هدف مولکولی برای شناسایی اشریشیا کلی Investigation of carbonic anhydrase-encoding genes and introduction of β-carbonic anhydrase as a molecular target for the detection of Escherichia coli تخصصي Special پژوهشي Research مقدمه: باکتری اشریشیا کلی (Escherichia coli) از جمله باکتری های آلوده کننده منابع آبی خصوصا آب آشامیدنی است. تست کیفی آب آشامیدنی از نظر عدم وجود آلودگی به باکتری اشریشیا کلی، به یک آزمون کنترل کیفی در دسترس  نیازمند است که تست مولکولی یکی از این روشهاست. باکتری ها دارای ژن های کد کننده کربنیک انهیدراز آلفا، بتا و گاما (α-CA, β-CA, γ-CA) می باشند که برای تشخیص مولکولی و دقیق آلودگی منابع آبی آلوده به باکتری های بیماریزا بسیار مناسب می باشند. یکی از روش های مولکولی رایج، واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR (Polymerase Chain Reaction) است. روش کار: برای شناسایی آنزیم های کربنیک انهیدراز اشریشیا کلی از روش بیوانفورماتیک و PCR استفاده شد. کشت میکروبی و آزمون های بیوشیمیایی میکروبی از قبیل محیط سه قندی آهن دار  (Triple Sugar Iron Agar یا TSI)، استفاده از تست VP (وگس پروسکوئر)، ایندول، تولید سیترات و اوره آز نیز برای شناسایی اشریشیا کلی انجام شدند. سپس، طراحی پرایمر، استخراج DNA، سنجش غظت DNA، آماده سازی میکس واکنش برای انجام آزمون PCR، و مشاهده نتیجه بر روی ژل الکتروفورز انجام شد. یافته ها: این تحقیق نشان داد که باکتری اشریشیا کلی دارای 19 آنزیم کربنیک انهیدراز مختلف است که عبارتند از یک آنزیم کربنیک انهیدراز آلفا، 12 آنزیم کربنیک انهیدراز بتا و 6 آنزیم کربنیک انهیدراز گاما. نتیجه این مطالعه نشان داد که از بین سه ژن کد کننده α-CA, β-CA, γ-CA، تشخیص ژن کد کننده β-CA  در باکتری اشریشیا کلی با موفقیت و طی مدت زمان 2 تا 3 ساعت انجام شد. نتیجه گیری: توالی کدکننده β-CA دارای این پتانسیل می باشد که به‌عنوان یک هدف نوین و اختصاصی برای شناسایی مولکولی اشریشیا کلی در منابع آبی و بدون نتایج مثبت کاذب مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که β-CA در مهره‌داران وجود ندارد، می‌تواند به‌عنوان یک نشانگر زیستی اختصاصی در شناسایی اشریشیا کلی کاربرد داشته باشد.   Introduction: Escherichia coli is one of the most important bacterial indicators of fecal contamination and is frequently used as a microbiological indicator for assessing the sanitary quality and safety of water, particularly drinking water. Therefore, the development of rapid, reliable, accessible, and specific methods for detecting E. coli contamination in water sources is essential for effective microbiological quality control and the prevention of waterborne infections. Carbonic anhydrases (CAs) are metalloenzymes involved in diverse physiological processes and are classified into several distinct evolutionary families, including the α-, β-, and γ-CA classes. The genes encoding these enzymes exhibit considerable sequence diversity among bacterial genera and species, making them potentially valuable targets for species-specific molecular detection. Polymerase chain reaction (PCR) provides a rapid and sensitive molecular approach for detecting specific microbial genetic targets. This study aimed to identify and evaluate suitable carbonic anhydrase-encoding genes as potential molecular targets for the specific detection of E. coli in water samples. Methods: Bioinformatic analyses demonstrated that E. coli possesses 19 distinct carbonic anhydrase enzymes, comprising 1 α-CA, 12 β-CAs, and 6 γ-CAs. The corresponding carbonic anhydrase-encoding genes were systematically evaluated to identify suitable targets for molecular detection. Among the identified genes, one α-CA, one β-CA, and one γ-CA gene were selected for experimental evaluation. Specific primers were designed for the selected target sequences, followed by extraction of E. coli genomic DNA and assessment of DNA concentration and purity using a NanoDrop spectrophotometer. PCR reaction mixtures were subsequently prepared, and amplification of the selected target sequences was performed. The resulting PCR products were visualized by agarose gel electrophoresis, and the amplified bands were subjected to sequencing to confirm the identity and specificity of the detected target sequences. Because the study did not involve human or animal subjects or samples, an institutional ethics approval code was not required. All experimental procedures involving E. coli were conducted under Biosafety Level 1 (BSL-1) conditions. The study was supported by Grants 815 and 847 from the National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB) and Grant 4003899 from the Iran National Science Foundation (INSF). No artificial intelligence tools were used in the design, analysis, or preparation of this study. Results: Among the three selected carbonic anhydrase gene targets representing the α-, β-, and γ-CA families, the β-CA-encoding sequence demonstrated successful and specific amplification for the detection of E. coli. The complete molecular detection procedure could be accomplished within approximately 2–3 hours, providing a considerably shorter turnaround time than conventional microbiological and biochemical identification procedures. These conventional approaches include a combination of biochemical assays, such as Triple Sugar Iron (TSI) agar, Voges–Proskauer (VP), indole production, citrate utilization, and urease tests, which generally require additional time for bacterial growth and phenotypic characterization. Sequencing of the amplified PCR product further confirmed the identity of the target sequence, supporting the suitability of the β-CA-encoding gene as a molecular target for E. coli detection. Conclusion: The findings of this study suggest that the β-carbonic anhydrase (β-CA)-encoding sequence may serve as a novel, specific, and potentially reliable molecular target for the rapid identification of E. coli in water sources. The successful amplification and subsequent sequence confirmation of this target indicate its potential utility in PCR-based microbiological quality-control assays. Because β-carbonic anhydrase is absent or substantially restricted in vertebrates, targeting the corresponding bacterial gene may provide an additional level of biological specificity for E. coli detection and may reduce the likelihood of nonspecific or false-positive amplification. Further validation using a larger collection of environmental water samples and a broader range of bacterial species is warranted to establish the analytical sensitivity, specificity, and practical applicability of this molecular detection strategy. اشریشیا کلی, کربنیک انهیدراز, تشخیص مولکولی, شناسایی میکروبی Escherichia coli, Carbonic Anhydrase, Polymerase Chain Reaction, Molecular Detection, Water Quality 0 0 http://aums.abzums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1759-1&slc_lang=fa&sid=1 Afagh Kiani آفاق کیانی afaaagh0096@gmail.com 100319475328460015306 100319475328460015306 No Department of Energy and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran گروه زیست فناوری انرژی و محیط زیست، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران Sara Minaeian سارا مینائیان minaeian.s@iums.ac.ir 100319475328460015307 100319475328460015307 No Antimicrobial Resistance Research Center, Institute of Immunology and Infectious Diseases, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran مرکز تحقیقات مقاومت های میکروبی، پژوهشکده ایمونولوژی و بیماری های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی ایران، تهران، ایران Bijan Bambai بیژن بمبئی bambai@nigeb.ac.ir 100319475328460015308 100319475328460015308 No Department of Systems Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran گروه زیست فناوری سامانه ای، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران Reza Zolfaghari Emameh رضا ذوالفقاری امامه zolfaghari@nigeb.ac.ir 100319475328460015309 100319475328460015309 Yes Department of Energy and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran گروه زیست فناوری انرژی و محیط زیست، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران