fa جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (psp) استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشریشیاکلی DH5 آلفا جهت دستیابی به واکسن تخصصي Special پژوهشي Research <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک، دیپلوکوک گرم مثبت به قطر ۵/۰ تا ۲/۱ میکرومتر، آلفا همولیتیک و تحمل‌کننده اکسیژن از جنس <em>استرپتوکوکوس</em></span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">و عامل بیماریهایی چون مننژیت و ذات الریه می‌باشد.باکتری حامل ژن پروتئین سطحی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">Pneumococcal</span></span> &nbsp;<span dir="LTR"><span style="color:black;">A<em> (</em>PspC<em>)</em></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">از </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">S</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> بوده و هدفی امیدوارکننده برای فرمولاسیون های واکسن جدید است. به همین جهت هدف از انجام این تحقیق جداسازی و کلونینگ ژن <em>پروتئین سطحی</em></span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"> (</span></span></em><span dir="LTR"><span style="color:black;">psp<em>)</em> </span></span><em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">استرپتوکوک پنومونیه</span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> در باکتری <em>اشرشیاکلی </em></span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">DH5</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> آلفا به منظور تهیه واکسن برای کودکان می‌باشد.</span></span></span><br> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">مواد و روش‌ها: </span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">نمونه‌ها از تعداد 100 کودک سالم، در مهـد کودک هـای شـهر اراک به طور تصادفی از نازوفارنژیال کودکان سالم زیـر 6 سـال</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;بود که در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسـازی شد. به منظور جداسازی و شناسایی اولیه <em>استرپتوکوک پنومونیه</em> از محیط کشت و آزمون های بیوشیمیایی استفاده شد و استخراج </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">DNA</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> صورت گرفت. از طریق آزمون </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">PCR</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> سویه های <em>واجد ژن </em></span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;">pspC</span></span></em><em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> شناسایی</span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> شد. ژن </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">pspC</span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">سویه های مثبت از طریق وکتور به باکتری میزبان<em> اشرشیاکلی </em>الحاق و از طریق تکنیک </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">TA</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> کلونینگ کلون شدند و در پایان از طریق تکنیک </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">Real time PCR</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> میزان بیان ژن‌ها در <em>اشرشیا کلی </em></span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">DH5</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> آلفا سنجیده و برای رسم درخت فیلوژنی از نرم‌افزار</span></span></span> <span dir="LTR"><span style="color:black;">clustalX</span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">و</span></span></span> <span dir="LTR"><span style="color:black;">Mega5</span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">استفاده شد.</span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span><br> &nbsp;<strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته ها:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> از غربالگری نمونه های بالینی ارسالی به آزمایشگاه که براساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی تعیین هویت شدند در مجموع 12 ایزوله <em>پنوموکوک </em>جداسازی شد</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">.</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> و از این تعداد 1 ایزوله دارای ژن </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">&nbsp;pspC</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> بود. پس از کلونینگ، ژن های </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">&nbsp;pspC</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">، سویه های کلون شده کلنی سلکشن (آبی/سفید) جداسازی شدند. به منظور تایید نتایج کلونینگ</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"> DNA , </span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">از کلنی های مشکوک استخراج و توسط آزمون </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">Real time PCR</span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> گردید.</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">در نهایت&nbsp; تصاویر سکانسینگ‌، </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">m13</span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">و منحنی تکثیر،&nbsp; بیان ژن</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">در باکتری <em>اشریشیاکلی </em></span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">DH5&alpha;</span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">را تایید کرد. </span></span></span><br> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه</span></span></span></strong> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;گیری:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> در این مطالعه با ارزیابی ژنومی <em>پنوموکوک جدا شده</em> از کودکان زیر 6 سال‌، &nbsp;<em>ژن </em></span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;">pspC</span></span><em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> با </span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">پتانسیل ایمن سازی و به منظور ساخت واکسن از این باکتری استخراج گردید &nbsp;و کلونینگ با موفقیت صورت گرفت. در نهایت با بررسی درخت فیلوژنی رسم شده در این مطالعه میزان تشابه و خویشاوندی گونه <em>استرپتوکوک پنومونیه</em> با سایر گونه‌ها نشان داده شد.</span></span></span> <strong>Background and Aim</strong>: Streptococcus pneumoniae or pneumococcus, gram-positive diplococcus with a diameter of 0.5 to 1.2 &mu;m, alpha hemolytic and oxygen tolerant of Streptococcus and causes diseases such as meningitis and pneumonia. The bacterium carries the Pneumococcal A surface protein gene <em>(PspA)</em> from S, and several studies show that PspA is a very promising target for new vaccine formulations. Therefore, the aim of this study was to isolate and clone the Streptococcus pneumoniae surface protein (psp) gene in Escherichia coli<em> DH5</em>&alpha; in order to provide a vaccine for children.<span dir="RTL"></span><br> <br> <strong>Methods:</strong> Sampling of a total of 60 pneumococcal isolates was isolated from nasopharyngeal samples of healthy children under 6 years of age. In order to isolate and initially identify Streptococcus pneumoniae, culture medium and biochemical tests were used and DNA extraction was performed. Then, strains with pspC gene were identified by PCR. The pspC gene of the positive strains was transfected into Escherichia coli host bacteria by vector and cloned by TA cloning technique. Finally, the expression of genes in Escherichia coli<em> DH5&alpha;</em> was measured by Real time PCR technique. ClustalX and Mega5 software were used to draw the phylogenetic tree.<span dir="RTL"></span><br> <strong>Results</strong>: A total of 12 pneumococcal isolates were isolated from the screening of clinical specimens sent to the laboratory, which were identified based on morphological, microscopic and biochemical characteristics. Of these, 1 isolate had pspC gene. After cloning, pspC genes were isolated from cloned selection colonies (blue / white). In order to confirm the results of DNA cloning, it was extracted from suspected colonies and PCR by real time test. Finally, sequencing images, m13 and proliferation curves, and confirmed gene expression in Escherichia coli<em> D</em>H5&alpha;.<span dir="RTL"></span><br> <strong>Conclusion</strong>: In this study, by genomic evaluation of pneumococci isolated from children under 6 years of age, pspC gene with immunization potential was extracted from this bacterium in order to make a vaccine. And cloning was successful. Finally, by examining the phylogenetic tree drawn in this study, the degree of similarity and kinship of Streptococcus pneumoniae with other species was shown.<span dir="RTL"></span> استرپتوکوک پنومونیه‌, pspC, کلونینگ Streptococcus pneumoniae, PspC, Clonin 73 88 http://aums.abzums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-331&slc_lang=fa&sid=1 Hajar Bagheri هاجر باقری 10031947532846008923 10031947532846008923 No Master of Microbiology, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Arak Branch, Arak, Iran کارشناس ارشد میکروبیولوژی، گروه بیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اراک، اراک، ایران Hamid Azadegan Qomi حمید آزادگان قمی 10031947532846008924 10031947532846008924 No Assistant Professor, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Arak Branch, Arak, Iran استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی ،واحد اراک، اراک، ایران Kiomars Amini کیومرث امینی Dr_kumarss_amini@yahoo.com 10031947532846008925 10031947532846008925 Yes Associate Professor, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran دانشیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران